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本产品是采用探针法进行一步法实时荧光定量检测的专用试剂盒。使用本制品进行Real-Time RT-PCR反应时以提取的RNA为模板，在同一反应管内连续进行反转录和荧光定量检测，操作简单，并能有效防止污染、降低加样误差。本产品基于高效的反转录酶、抗体型Hotstart Taq DNA聚合酶配合优化的Buffer体系研制，在提高检测灵敏度的同时保证了扩增的特异性；非常适合于RNA病毒等微量目标基因的检测。本产品使用时只需加入模板、引物、ROX Reference Dye（用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，根据不同荧光定量PCR仪选择使用）和水，使其工作浓度为1×，即可进行反应。具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度地减少人为误差、节约PCR实验操作时间、降低污染几率。

组分	100T	500T
One-Step Probe Enzyme Mix	200μL	1mL
2×One-Step Probe Buffer	1mL	5×1mL
ROX I(50×)	40μL	200μL
ROX II(50×)	40μL	200μL
DEPC水	1mL	3×1.5mL

保存：-20℃，避光，有效期6个月。

• 实验过程中请注意避免RNase污染。
  
• 除酶以外的各种试剂，使用之前请完全溶解并充分混匀，以防因盐离子浓度不均影响实验结果。
  
• 如果扩增片段较长或者RNA结构复杂，可以将RNA单独置于65℃加热5～10min后再加入体系，可提高反转录效率。
  
• 本制品只能使用基因特异性引物，不能使用Random Primer和Oligo dT Primer等进行反转录反应。
  
• 当同时需要进行数次qRT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。
  
• 使用One-Step Probe Enzyme Mix时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。-20℃保存，使用后立即放回冰箱。

• 按下表加入各成分配制反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  RNA模板	2μL	10pg～100ng
  上游引物(10μM)	0.5μL	0.25μM
  下游引物(10μM)	0.5μL	0.25μM
  探针(10μM)	0.5μL	0.25μM
  2×One-Step Probe Buffer	10μL	1×
  One-Step Probe Enzyme Mix	2.0μL	-
  ROX I/ROX II(50×)	0.4μL	1×
  DEPC水	至20μL	-

  
  注：
  ① 推荐20μL反应体系中加入Total RNA的量为10pg～100ng。
  ② 引物的终浓度可在0.1μM～1μM之间调整。
  ③ 探针的终浓度可在50nM～250nM之间调整。
  ④ 请根据real time PCR仪的型号，选择对应的ROX。
  
  • 需加入ROX I(50×)的机型:ABI Prism7000/7300/7700/7900HT和ABI Step One/ABI Step One Plus。
    
  • 需加入ROX II(50×)的机型:ABI Prism7500/7500 Fast,MJ Research Chromo4,Opticon (II),Corbett Rotor Gene 3000。
  
  
• 设置反应程序
  
  • 两步法
    

    过程	温度	时间	循环数
    反转录	50℃	5～15min	1
    预变性	94℃	2min	1
    变性	94℃	15s	35～45
    退火/延伸	60℃	15-30s
    熔解曲线	机器自动设置

    
    
  • 三步法
    

    过程	温度	时间	循环
    反转录	50℃	5～15min	1
    预变性	94℃	2min	1
    变性	94℃	15s	35～45个循环
    退火	60℃	15s
    延伸	72℃	30s
    熔解曲线	机器自动设置

  
  注：
  ① 通常PCR产物长度在80～200bp，此时采用5min的反转录时间即可。
  ② 当两步法扩增效率不好的时候建议选择三步法进行qPCR反应。

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